Способ выращивания растений in vitro. Все растения из нашего питомника получены по-технологии «in vitro Растения in vitro

Использование: сельское хозяйство и биотехнология. Сущность изобретения: питательная среда содержит минеральные соли и регуляторы роста, при этом в агаризованную питательную среду вводят дополнительно тетраметилтиурамсульфид (ТМТД) в количестве 25-100 мг/л или 25-100 мг/л ТМТД и 1-20 мг/л фундазола, или 25-100 мг/л ТМТД и 1-20 мг/л фундазола в сочетании с 2,5-50 мг/л метиленового синего и 1-10 мг/л бриллиантового зеленого, а в питательную среду с твердым носителем вводят дополнительно 20-100 мг/л ТМТД или 25-100 мг/л нистатина. 2 табл.

Изобретение относится к области сельского хозяйства и биотехнологии, в частности к способам микроклонального размножения растений и безвирусному семеноводству. Известен способ микроклонального размножения и выращивания растений in vitro путем посадки микрочеренков на питательную среду, содержащую элементы минерального питания по Мурасиге-Скугу и регуляторы роста. Недостатком указанного способа является частое "зарастание" питательной среды микроорганизмами-контаминантами при нарушении условий стерильности. Размножение микроорганизмов приводит к накоплению токсических веществ и вследствие этого гибели части растений и, следовательно, возрастанию затрат для получения необходимого их количества, и(или) для поддержания более высокого уровня стерильности. Цель изобретения - подавление роста микроорганизмов-контаминантов, упрощение способа и снижение затрат при выращивании растений in vitro. Предлагаемый способ выращивания растений in vitro заключается в следующем. Посадка микрочеренков в стерильных условиях производится на питательную среду, содержащую минеральные соли, сахарозу, агар-агар и регуляторы роста, в состав которой дополнительно вводят 25-100 мг/л тетраметилтиурамдисульфида (ТМТД) или ТМТД (25-100 мг/л) и фундазол в количестве 1-20 мг/л или ТМТД(25-100 мг/л) и фундазол (1-20 мг/л) в сочетании с метиленовым синим 2,5-50 мг/л и бриллиантовым зеленым - 1- 10 мг/л. Предлагаемый способ отличается от известного способа выращивания in vitro тем, что в состав питательной среды дополнительно вводят соединения, обладающие биоцидной активностью против наиболее часто встречающихся в практике микроразмножения растений видов микроорганизмов грибной и бактериальной природы: ТМТД или ТМТД в сочетании с фундазолом или ТМТД в сочетании с фундазолом, метиленовым синим и бриллиантовым зеленым. В результате применения данного способа гибель растений вследствие "зарастания" питательной среды микроорганизмами-контаминантами снижается в 2 и более раз. Соответственно снижаются затраты, необходимые для выращивания дополнительного числа растений. При поддержании коллекций сортов и форм in vitro иногда возникает ситуация "зарастания" всех пробирок данного сорта с угрозой его потери. В случае контаминации чувствительными микроорганизмами черенкование инфицированных растений на предложенную среду позволяет сохранить коллекционный образец. Посадка микрочеренков в стерильных или нестерильных условиях производится на стерилизованный прокаливанием перлитовый песок, пропитанный жидкой минеральной питательной средой без органических добавок, в состав которой дополнительно вводят 20-100 мг/л тетраметилтиурамдисульфида (ТМТД) или 25-100 мг/л нистатина. Применение компонентов с альгицидной активностью - ТМТД или нистатина - устраняет зарастание микроводорослями, выделяющими токсичные для растений соединения, при выращивании в нестерильных условиях или при случайном нарушении стерильности. Это позволяет также последнее микрочеренкование перед высадкой в теплицу проводить в нестерильных условиях, что позволяет упростить способ выращивания за счет более удобных манипуляций с черенками в нестерильных условиях и уменьшить необходимые площади по сравнению с пробирочной культурой. Пример 1. Биоцидные компоненты в указанных табл. 1 и 2 концентрациях были добавлены к питательной среде для микрочеренкования, содержащей минеральные соли по Мурасиге-Скугу и регуляторы роста, а также 7 г/л агар-агара и 20 г/л сахарозы, перед ее стерилизацией автоклавированием (120 o C, 20 мин). Черенки растений картофеля, поддерживавшихся in vitro в стерильной культуре, с одним-двумя междоузлиями высаживали в пробирки с питательной средой и выращивали 3-4 нед при температуре 20 o C и освещенности 5000 лк. Учитывали число случайных зарастаний грибной и бактериальной инфекцией. Как видно из табл. 1, суммарное зарастание контаминантами грибной природы снижается в два и более раз при введении в состав среды ТМТД и фундазола. При этом зарастание Penicillium sp. подавляется полностью (в контроле 1.3%), а рост бактерий изменяется незначительно (табл. 2). Введение в состав среды метиленового синего и бриллиантового зеленого является эффективным в качестве антибактериального средства (табл. 2). Пример 2. Черенки растений картофеля, поддерживавшихся in vitro в стерильной культуре, с одним-двумя междоузлиями нестерильно высаживали на перлитовый субстрат, стерилизованный прокаливанием 2 ч при 170 o C и помещенный в чашки Петри, пропитанный питательной средой, содержащей раствор Кноппа или минеральные соли по Мурасиге-Скугу с добавлением регуляторов роста, а также биоцидных компонентов: 25 мг/л ТМТД или 25 мг/л нистатина. По мере подсыхания субстрата проводили полив дистиллированной водой (примерно, 1 раз в неделю). Через две недели в контрольном варианте (без добавления ТМТД или нистатина) отмечено зарастание микроводорослями, в вариантах с добавлением ТМТД и нистатина зарастание отсутствует, вес надземной части растения составляет 100-180% от контроля. Через 1 мес после посадки в контрольном варианте отмечено бурное развитие микроводорослей на поверхности перлита, растения угнетены, отдельные растения погибли, в опытных вариантах небольшой рост водорослей в местах полива, развитие растений нормальное.

Формула изобретения

Способ выращивания растений in vitro, включающий микрочеренкование и посадку микрочеренков на питательную среду, содержащую минеральные соли и регуляторы роста, отличающийся тем, что посадку микрочеренков осуществляют на агаризованную питательную среду с сахарозой или на питательную среду с твердым носителем, в качестве которого используют перлит, при этом в агаризованную питательную среду вводят дополнительно ТМТД в количестве 25 100 мг/л, или 25 100 мг/л ТМТД и 1 20 мг/л фундазола, или 25 100 мг/л ТМТД и 1 20 мг/л фундазола в сочетании с 2,5 50,0 мг/л метиленового синего и 1 10 мг/л бриллиантового зеленого, а в питательную среду с твердым носителем вводят дополнительно 20 100 мг/л ТМТД или 25 100 мг/л нистатина.

Похожие патенты:

Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано при диагностике гепатита В

Изобретение относится к области ветеринарной биотехнологии, в частности, к получению штамма гибридных клеток, продуцирующих моноклональные антитела, которые могут быть использованы для приготовления высокоспецифических диагностических реагентов с целью идентификации и количественного определения уровня иммуноглобулинов G класса в биологических жидкостях организма свиньи

Наша компания на основе технологии клонального микроразмножения растений производит посадочный материал трёх категорий:

• Микрорастения in vitro , сокращенное обозначение “In Vitro ” (рис. 1)
• Микрорастения in vitro неукоренненные - in vitro Н.У.
• Адаптированный посадочный материал с закрытой корневой системой (ЗКС), сокращенное обозначение “Ex Vitro (ЗКС) ”

В этой статье мы с Вами рассмотрим производство микрорастений In Vitro .

Микрорастения in vitro – это посадочный материал нового поколения, обладающий рядом неоспоримых преимуществ по сравнению с растениями, полученными традиционными методами размножения (отводки, черенкование, прививка), а именно:

• Растения свободны от фитопатогенов;
• Обладают повышенными темпами роста и развития, а в некоторых случаях и более ранним началом цветения и плодоношения;
• Высокая выравненность посадочного материала вследствие его генетической однородности;
• Возможность размножения в неограниченных количествах гибридных форм растений, с сохранением всех ценных признаков;
• Отсутствие сезонности при производстве посадочного материала;
• Возможность производства больших объемов посадочного материала в сжатые сроки;
• Относительно низкая стоимость по сравнению с классическими типами посадочного материала.

Выращивание микрорастений в стандартизированных условиях обеспечивает высокую степень однородности посадочного материала между различными партиями, что дает возможность нашим клиентам более точно планировать объемы и сроки посадок.

Герметичная пластиковая тара и питательный субстрат, в котором выращиваются микрорастения, дают возможность транспортировки продукции на дальние расстояние с сохранением жизнеспособности и посадочных качеств микрорастений, что подтверждается широкой географией наших постоянных клиентов. Компактность упаковки и небольшой вес контейнеров значительно уменьшают транспортные расходы.

Особенности данного способа размножения позволяют в сжатые сроки получать омоложенный оздоровленный посадочный материал как старых, но не теряющих свою актуальность, сортов так и селекционных новинок.

Недостатки:

Основной сложностью при работе с микрорастениями является процесс их адаптации к естественным условиям. Проведение адаптации микрорастений требует определенных навыков и наличия теплиц для первичного доращивания растений in vitro. Адаптация производится в условиях повышенной влажности и с применением других специальных мер по уходу (см. рекомендации по уходу). Требуемые условия необходимо соблюдать в первые 3-5 недель (в зависимости от вида растений) после высадки микрорастений в субстрат. Допустимый выпад (гибель) микрорастений при соблюдении оптимальных условий адаптации составляет 5 – 10% в зависимости от культуры и сорта.

Ключевым потребителем продукции категории "микрорастения in vitro " являются тепличные хозяйства, располагающие зимними отапливаемыми теплицами (агрофирмы, тепличные комбинаты, питомники, фермерские хозяйства и т.д.).

Также мы производим микрорастения флоксов in vitro неукоренненные - in vitro Н.У.

Совмещение стадий укоренения и адаптации микропобегов флоксов открывает возможность увеличения эффективности производства для этой культуры и позволяет значительно сократить сроки получения готовых растений.

• Наличие меристематических очагов, дающих начало корневым зачаткам, позволяет растению развить полноценную корневую систему
• Высадка в теплицу, уход и доращивание не требуют дополнительных усилий
• Микрорастения имеют высокую приживаемость
• По морфологическим показателям микрорастения не отличаются от укорененных in vitro

Заветное желание обзавестись растительной новинкой производства Голландии, Таиланда, Японии, США, Польши, Франции и других передовых в селекции растений стран при минимальном капиталовложении провоцирует рассматривать такую позицию как меристемные растения или растения in vitro , а значит приобрести растения в пробирках, колбах или баночках и самостоятельно их адаптировать к условиям выращивания в грунте. Сразу возникает вопрос – что же это такое и как им пользоваться.

Услышав термин «растение из пробирки», многие ассоциируют его с генно-модифицированными растениями. Это заблуждение, в обычной культуре in vitro генную инженерию никто не применяет, все гены остаются на тех позициях, которые уготовила для них матушка-природа.

Меристемный метод размножения растений – это вегетативный метод размножения растения, который осуществляется с помощью микрочеренкования, а именно черенкованием самой верхушечкой побега – меристемой. Отсюда метод и получил свое название.

Размножать растения меристемным способом в домашних условиях проблематично, для этого необходимо специальное лабораторное оборудование, инструменты и посуда, стерильные условия, специальные питательные среды, гормоны и еще кое-что. Но можно приобрести уже готовые комнатные и садовые растения, размноженные in vitro , по каталогам садоводческих фирм, и самостоятельно их адаптировать к условиям внешней среды с помощью наших рекомендаций.

Преимущества меристемных растений

1. Отсутствие грибковых, вирусных и бактериальных инфекций;

2. Генетическая однородность посадочного материала

3. Размножение гибридных растений или растений с редкими признаками, которые при семенном размножении могут быть утеряны

4. Возможность поставок растений круглогодично

5. Размножение растений, которые не дают семенного потомства

6. Увеличение темпов роста и развития растения

7. Низкая стоимость посадочного материала

Пересадка растения из пробирки в почву

1. За сутки перед высадкой меристемных растений из контейнера необходимо подготовить почвенный субстрат. Для этого нужно взять подходящую для культуры почвенную смесь и обработать ее либо термическим, либо химическим способом.

— Термический способ в домашних условиях: почву пропаривают при температуре 100 ºС на протяжении 1 часа.

— Если не хочется разводить грязь на кухне, почву можно обработать с помощью фунгицидов. Для этого применяют раствор марганцовки или препаратов Фитоспорин-М, Превикур, Витарос, Максим.

Целесообразно для высаживания меристемных растений использовать торфяные таблетки. Изначально при производстве торфотаблетки пропариваются, поэту наличие в них инфекций и вирусов исключено. При выращивании растений в торфяных таблетках также необходимо дополнительно вносить подкормки.

2. Прежде чем распечатать контейнер с меристемными растениями, необходимо подготовить пинцет, чтобы его извлечь и раствор марганцовки для промывания корней от питательной среды, в которой оно росло. Кроме этого, предварительно нужно сформировать лунки в посадочной смеси.

3. Для промывания корней понадобится около 1 л раствора марганцовки и такая емкость, чтобы вам было удобно производить все манипуляции, например небольшой тазик. Раствор должен получиться бледно-розового цвета, чтобы не обжечь растения.

5. Аккуратно освободите корневую систему растения из пробирки от геля, тщательно промывая ее в растворе марганцовки. Остатки питательной среды могут провоцировать развитие плесени.

6. А теперь можно приступить непосредственно к посадке растения в субстрат.

7. После этого поместите высаженные растения в парник или аквариум, постепенно закаляйте их, не забывая при этом соблюдать оптимальный для данного вида растения режим влажности.

8. Процесс закаливания займет почти месяц, затем можно высаживать растение в открытый грунт.

Адаптация меристемных растений к условиям внешней среды

Если вы прочитали на этикетке, что меристемные растения не болеют, это значит, что вам доставили здоровый безвирусный материал. Но только вы вынули его из стерильных условий контейнера, как тут же на него со всей силой набросятся инфекции из окружающей среды. Поэтому при появлении первых признаков грибковых или бактериальных инфекций сразу обрабатывайте растение фунгицидом.

Недостатки меристемных растений

В принципе, недостатков у меристемных растений не может быть. Но, как говорится, человеческий фактор может сыграть свою роль и здесь. Желание нечестных предпринимателей быстро и много заработать может привести к тому, что на начальном этапе введения растения в культуру использовали низкокачественные среды или не добавили достаточного количества нужных гормонов, в этом случае растение может утратить некоторые ценные качества. Поэтому приобретать меристемные растения нужно на предприятиях, хорошо зарекомендовавших себя на рынке производства посадочного материала.

Наталья Высоцкая, дендролог, кандидат с. -х. наук.

2012 — 2014, . Все права защищены.

Мы создали собственную лабораторию и освоили технологию производства элитного посадочного материала голубики высокорослой , ежевики , жимолости съедобной , малины, брусники.

Культура in vitro – выращивание клеток, тканей, органов на искусственной питательной среде в абсолютно стерильных условиях при контролируемых физических факторах (свет, температура, влажность, фотопериодичность).

Микроклональное размножение – разновидность вегетативного размножения растений в культуре in vitro. Оно освоено на явлении тотипотентности (способность нести и восстанавливать генетическую информацию растений).

Преимущества микроклонального размножения

• Метод обеспечивает высокий коэффициент размножения, что дает возможность быстро внедрить в производство новые сорта растений.
• В процессе размножения обеспечивается оздоровление посадочного материала.
• Требуется небольшое количество стартового материала.
• Выполнение работ осуществляется в лабораторных условиях и не зависит от факторов внешней среды.
• Возможность размножения растений, трудно размножаемых в естественных условиях.

Исходным материалом для введения растений в культуру обычно служат элитные растения, типичные для сорта и без признаков инфекции.

Этапы микроклонального размножения

• I. Стерилизация эксплантов (любая часть растения, культивируемая в условиях in vitro). Введение в культуру in vitro. На этом этапе важно обеспечить успешное помещение экспланта на питательную среду, наблюдая тем самым растяжение тканей путем дифференциации клеток растения.
• II. Собственно размножение. Целью этапа является увеличение числа побегов в культуре in vitro. Размножение на этом этапе является важным моментом. Индуцируются меристематические центры, которые развиваются в почке или побеге.
• III. Укоренение и адаптация в нестерильных условиях. На этом этапе удлиняются побеги, индуцируются корни, затем осуществляется перенос в тепличные условия.

Получить больше информации

По вопросам IN-VITRO и для заказа саженцев — звоните или приезжайте .

В лаборатории

Для того чтобы получить копию растения с максимальной похожестью свойств желательно такое растение размножать не генеративно, т.е. семенами, а вегетативно, т.е. частями самого растения. Такими частями могут быть черенки, корневые деленки, подземные и боковые побеги, дочерние луковицы, усы и т.п. Растения, полученные таким способом — генетически идентичны исходному экземпляру. Они называются его клонами, а размножение растений такими способами — называются клонированием этого растения. Клонирование – доступный каждому способ размножения растений, не имеющий отношения к генной инженерии, а полученные таким способом растения не являются ГМО. При клонировании стоит задача получить растение с сохранённым генотипом, а не модифицировать его.

За счёт капиллярности вещества из питательной среды начинают поступать к клеткам меристемы. Клетки начинают делиться и расти и, соответственно, начинает расти наш микроскопический срез меристемы. По мере роста он превращается в миниатюрное растение, которое генетически идентично исходному растению, с верхушечной точки которого брали срез. У растения образуются точка роста, листья, ствол, корень, закладываются почки возобновления.

У учёных-биологов эта процедура называется «введение в культуру in vitro». Это означает, что растение начинает культивироваться (выращиваться при помощи человека) в стеклянной лабораторной посуде в стерильных условиях и искусственном питании. В условиях in vitro растение начинает получать всё необходимое ему для роста и развития из питательной среды. Получая сахара для питания, растение перестаёт нуждаться в их самостоятельном производстве и процессы фотосинтеза сильно замедляются. Замедлению фотосинтеза способствует обеднение воздуха внутри пробирки углекислым газом так как нет его притока кроме продуктов дыхания самого растения. Из-за такого способа питания, на который обречено растение in vitro у самого растения изменяется метаболизм, образуются изменённые и недоразвитые органы. Так 100% относительная влажность и стабильная температура не дают развиться у растения системе термо- и влаго-регуляции. Растения имеют полностью открытые устица на внутренней поверхности листьев, но они не испаряют воду из-за 100% относительной влажности. Растения не производят растительный воск, который должен был бы предохранять их от высыхания и перегрева. Корни вырастают «ленивыми». Они толстые, длинные, на них отсутствуют волосовидные корешки, которые в «обычной» жизни растения выполняют важную функцию всасывания влаги и питательных веществ из почвы.

У растений средней полосы, да и у большинства других, существует чёткая цикличность в развитии. «Дирижёром» этого развития является внешняя среда. Температура, влажность, продолжительность светового дня – все эти факторы «подсказывают» растению в какой части биологического цикла оно находится и к чему нужно готовиться. Механизм влияния прост. При воздействии внешнего фактора в растении вырабатываются определённые химические вещества, которые участвуя в обмене веществ растения, доносят указания «дирижёра» до соответствующих органов растения и запускают соответствующие внутренние биологические процессы. Такие вещества называются растительными гормонами. Растения же содержащиеся в условиях in vitro практически лишены влияния природной среды. Исключение составляет, разве что, только атмосферное давление. Поэтому для управления биологическими циклами и процессами у растений in vitro нашли очень простой способ – гормоны им добавляет в питательную среду сам человек. Получив такую гормональную команду, растение запускает требуемые нам биологические процессы. Так на определённом этапе растению добавляют в питательную среду гормон роста, и оно начинает образовывать боковые побеги. Эти побеги в стерильных условиях аккуратно срезают и помещают опять на питательную среду для укоренения и роста в стерильных условиях in vitro. Такая процедура называется «микрочеренкованием» и отличается от обычного черенкования только стерильными условиями и микроскопическим размером черенков. Следует сказать, что стерильные условия для микрочеренкования обеспечиваются в первую очередь проведением всех манипуляций в ламинарном шкафу.

После укоренения мы имеем первое поколение клонов. Для получения необходимого количества растений на выходе нужно просто провести несколько таких циклов клонирования и после каждого цикла будем получать увеличивающееся с геометрической прогрессией количество растений. Предположим, мы эти шаги проделали нужное число раз и имеем in vitro нужное нам большое количество одинаковых по размеру и генетически тождественных друг другу микроскопических растений.
Теперь перед нами стоит задача вынуть растения из пробирок и приучить их жить и развиваться вне пробирок — в обычных условиях, как говорят биологи — ex vitro. Такая процедура является обратной процедуре введения в культуру in vitro и называется адаптация. В процессе адаптации растение должно:

1. Научиться заново фотосинтезу. Т.е. уметь самостоятельно запасать для себя в нужных количествах энергию света синтезируя полисахара из воды и углекислого газа.
2. Вырастить на корнях волосовидные корешки и через них снабжать себя влагой и растворами солей из почвы.
3. Научиться сужать и вообще закрывать устица для регулирования количества испаряемой влаги с целью регулирования скорости обмена веществ и защиты от перегрева и высыхания.
4. Научиться вырабатывать растительный воск на покровных тканях для защиты от неблагоприятных факторов.
5. Подрасти и укрепиться для последующей акклиматизации.

Адаптация не менее сложный и важный процесс в размножении растений наравне с введение в культуру in vitro. Не все растения могут пройти путь от жизни в пробирке к жизни вне пробирки. Для облегчения растениям этого пути используются специальные установки, позволяющие плавно менять параметры внешней среды и защищать юные растения от быстрого заражения патогенной флорой и фауной.


Растения, прошедшие адаптацию — уникальны по своим свойствам.

Во-первых, они молоды. Биологический возраст растений размноженных in vitro начинает отсчитываться с нуля, в отличие от растений, полученных обыкновенным черенкованием, которые частично наследуют возраст маточного растения. Юные растения быстрее растут и развиваются.

Во-вторых, они абсолютно здоровы, что опять-таки хорошо сказывается на их росте, урожайности и способности хорошо размножаться вегетативно.

В-третьих, они, как говорят садоводы, корнесобственные. Это означает, что все части полученных растений генетически идентичны, что увеличивает их сортовую выживаемость. Это положительное свойство всех черенкованных растений даёт им превосходство над привитыми растениями. Последние в случае утраты надземной части и возобновления роста восстанавливаются как дички, на которые была сделана прививка. Сирень же полученная методом микрочеренкования, даже поросль будет давать сортовую.

В-четвёртых, после размножения растений in vitro укореняемость их черенков при обычном черенковании значительно увеличивается.

Продолжая перечислять положительные стороны размножения растений по технологии микрочеренкования, следует сказать, что эта технология позволяет размножать такие виды и сорта растений, которые не укореняются совсем или крайне плохо укореняются при обычном черенковании. Ещё можно заметить, что сложность и, соответственно, затратность микроклонального размножения вынуждает производителей особо тщательно выбирать сорта для массового размножения. В первую очередь для размножения in vitro отбираются особо качественные, высокодекоративные и урожайные сорта повышенного спроса.
Ввиду сказанного становится понятно, что выращиваемые нами растения по сортности являются супер-суперэлитой в агрономической терминологии. Хотя в картофелеводстве супер-суперэлитой называется семенной картофель, полученный на второй год выращивания в открытом грунте. Наши же растения после адаптации высаживаются в пластиковые контейнеры, заполненные специально подобранной грунтовой смесью на основе торфа. Превосходство технологии in vitro описывают в своей работе ученые из Института биоорганической химии РАН и РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева. Так приведённая ниже Таблица 1 из их работы, наглядно показывает разницу в коэффициенте размножения растений земляники, полученной in vitro и выращенной обычным способом.

Выращенные в контейнерах растения можно свободно перевозить и высаживать в грунт в течение всего тёплого периода года. Состав смеси позволяет удерживать влагу продолжительное время. Но даже обильный полив перед дальней перевозкой не повредит нашему растению, так как в состав субстрата входят разрыхляющие и удерживающие воздух компоненты — корни не задохнутся. В состав субстрата также входят комплексные удобрения с микроэлементами длительного периода действия, что позволяет продолжительное время держать растение до посадки в контейнере, обходясь лишь периодическими поливами.


Автор статьи:
Диев А.Б.

Использованная литература.

1. В.Г. Лебедев, А.Б. Азарова, К.А. Шестибратов, В.И. Деменко. Проявление самоклональной изменчивости у микроразмноженных и трансгенных растений // Известия ТСХА. 2012. N1. С. 153-163.